多管發(fā)酵法
實驗九 水中總大腸菌群的測定－多管發(fā)酵法
一、實驗目的和要求
1、掌握多管發(fā)酵法測定水中總大腸菌群的技術。
2、預習第二章有關活性污泥的有關內容。
二、原理
總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢驗。多管發(fā)酵法的原理是根據大腸菌群細菌能發(fā)酵乳糖、產酸產氣以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關特性，通過三個步驟進行檢驗求得水樣中的總大腸菌群數。試驗結果以最可能數（most probable number），簡稱MPN表示。
三、儀器
1.高壓蒸氣滅菌器。
2.恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。
3.生物顯微鏡、載玻片。
4.酒精燈、鎳鉻絲接種棒。
5.培養(yǎng)皿（直徑100mm）、試管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、燒杯（200、500、2000mL）、錐形瓶（500、1000mL）、采樣瓶。
培養(yǎng)基及染色劑的制備：
1.乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：將10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調節(jié)溶液pH為7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管中，于121℃高壓滅菌器中滅菌15min，貯存于冷暗處備用。
2.三倍濃縮乳糖蛋白陳培養(yǎng)液：按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法配制。除蒸餾水外，各組分用量增加至三倍。
3.品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基
（1）貯備培養(yǎng)基的制備：于2000mL燒杯中，先將20—30g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入3.5g磷酸氫二鉀及10g蛋白胨，混勻，使其溶解，再用蒸餾水補充到1000mL，調節(jié)溶液pH至7.2—7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加10g乳糖，混勻，定量分裝于250或500mL錐形瓶內，置于高壓滅菌器中，在121℃滅菌15min，貯存于冷暗處備用。
（2）平皿培養(yǎng)基的制備：將上法制備的貯備培養(yǎng)基加熱融化。根據錐形瓶內培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量的5%堿性品紅乙醇溶液，置于滅菌試管中；再按比例稱取無水亞硫酸鈉，置于另一滅菌空試管內，加滅菌水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（滅菌）。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內至深紅色再退至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已融化的貯備培養(yǎng)基內，并充分混勻（防止產生氣泡）。立即將此培養(yǎng)基適量（約15mL）傾入已滅菌的平皿內，待冷卻凝固后，置于冰箱內備用，但保存時間不宜超過兩周。如培養(yǎng)基已由淡紅色變成深紅色，則不能再用。
4.伊紅美藍培養(yǎng)基
（1）貯備培養(yǎng)基的制備：大學網于2000mL燒杯中，先將20—30g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解。再加入2g磷酸二氫鉀及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸餾水補充至1000mL，調節(jié)溶液pH值至7.2—7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入10g乳糖，混勻后定量分裝于250或500mL錐形瓶內，于121℃高壓滅菌15min，貯于冷暗處備用。
（2）平皿培養(yǎng)基的制備：將上述制備的貯備培養(yǎng)基融化。根據錐形瓶內培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的2%伊紅水溶液（0.4g伊紅溶于20mL水中）和一定量已滅菌的'0.5%美藍水溶液（0.065g美藍溶于13mL水中），加入已融化的貯備培養(yǎng)基內，并充分混勻（防止產生氣泡），立即將此培養(yǎng)基適量傾入已滅菌的空平皿內，待冷卻凝固后，置于冰箱內備用。
5.革蘭氏染色劑
（1）結晶紫染色液：將20mL結晶紫乙醇飽和溶液（稱取4—8g結晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1%草酸銨溶液混合、過濾。該溶液放置過久會產生沉淀，不能再用。
（2）助染劑：將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補充至300mL。此溶液兩周內有效。當溶液由棕黃色變?yōu)榈S色時應棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。
（3）脫色劑：95%乙醇。
（4）復染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加90mL蒸餾水。
四、測定步驟
1.生活飲用水
（1）初發(fā)酵試驗：在兩個裝有已滅菌的50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內有倒管），以無菌操作各加入已充分混勻的水樣100mL。在10支裝有已滅菌的5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內有倒管），以無菌操作加入充分混勻的水樣10mL，混勻后置于37℃恒溫箱內培養(yǎng)24h。
（2）平板分離：上述各發(fā)酵管經培養(yǎng)24h后，將產酸、產氣及只產酸的發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍培養(yǎng)基或品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱內培養(yǎng)24h，挑選符合下列特征的菌落。
①伊紅美藍培養(yǎng)基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。
②品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心色較深的菌落。（3）取有上述特征的群落進行革蘭氏染色
①用已培養(yǎng)18—24h的培養(yǎng)物涂片，涂層要薄。
②將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結晶紫溶液，1min后用水洗去。
③滴加助染劑，1min后用水洗去。
④滴加脫色劑，搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約20—30s），用水洗去。
⑤滴加復染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。
4.復發(fā)酵試驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內有倒管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落1—3個，然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，有產酸、產氣者（不論倒管內氣體多少皆作為產氣論），即證實有大腸菌群存在。根據證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數查后附表1“大腸菌群檢數表”，報告每升水樣中的大腸菌群數。
2.水源水
（1）于各裝有5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管中（內有倒管），分別加入10mL水樣；于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管中（內有倒管），分別加入1mL水樣；再于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管中（內有倒管），分別加入1mL1： 10稀釋的水樣。共計15管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于37℃恒溫箱內培養(yǎng)24h。
（2）平板分離和復發(fā)酵試驗的檢驗步驟同“生活飲用水檢驗方法”。
（3）根據證實總大腸菌群存在的陽性管數，查后附表2“最可能數（MPN）表”，即求得每100mL水樣中存在的總大腸菌群數。我國目前系以1L為報告單位，故MPN值再乘以10，即為1L水樣中的總大腸菌群數。
例如，某水樣接種10mL的5管均為陽性；接種1mL的5管中有2管為陽性；接種1：10的水樣1mL的5管均為陰性。從最可能數（MPN）表中查檢驗結果5-2-0，得知100mL水樣中的總大腸菌群數為49個，故1L水樣中的總大腸菌群數為49×10=490個。
對污染嚴重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗的接種水樣應作1：10、1：100、1：1000或更高倍數的稀釋，檢驗步驟同“水源水”檢驗方法。
如果接種的水樣量不是10mL、1mL和0.1mL，而是較低或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得MPN指數，再經下面公式換算成每100mL的MPN值。
表1 大腸菌群檢數表
接種水樣總量300mL(100mL2份，10mL10份)
表2 最可能數(MPN)表
（接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣時，不同陽性及陰
性情況下100mL水樣中細菌數的最可能數和95%可信限值）
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