蛋白質含量測定方法的比較

第３１卷第４期２００８年０４月Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．４Ａｐｒ．２００８第一文庫網(wǎng)

蛋白質含量測定方法的比較

郭穎娜，孫

（華北制藥股份有限公司，河北

［摘

衛(wèi)

石家莊

０５００２７）

存在和進化都密切相關，蛋白質含量測定涉及到生產和科研的眾多領域。目前常用的方法有要］蛋白質與生命的起源、

凱氏定氮法、雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）、紫外吸收法、考馬斯亮藍法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）。本文總結各種方法的特點及適用條件，針對不同的待測樣品以及對測定結果準確性的要求不同，我們可以采用不同的方法來測定樣品中蛋白質的含量。

［關鍵詞］蛋白質；凱氏定氮法；雙縮脲法；紫外吸收法；考馬斯亮藍法［中圖分類號］ＴＳ２１２．７

［文獻標識碼］Ａ

［文章編號］１００３－５０９５（２００８）０４－００３６－０２

蛋白質含量測定方法，是生物化學研究中最常

用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）、紫外吸收法、考馬斯亮藍法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）。其中Ｂｒａｄｆｏｒｄ法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏１０～２０倍，比Ｂｉｕｒｅｔ法靈敏１００倍以上。凱氏定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。這４種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，每種方法都有其優(yōu)缺點，在選擇方法時應考慮：⑴實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；⑵蛋白質的性質；⑶溶液中存在的干擾物質；⑷測定所要花費的時間。

１凱氏定氮法１．１原理

凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定４個過程。其原理是樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機物分解產生氨，氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨，氨用過量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標準溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質含量。１．２特點

凱氏定氮法是目前分析有機化合物含氮量常用的方法，是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一，被國際國內作為法定的標準檢驗方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條件為硫酸銅２．５０ｇ，硫酸鉀０．１０ｇ，濃硫酸４．００ｍＬ；硫酸銅的用量為影響消化時間的主要因素，硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最佳條件做實驗，消化時間僅為

［收稿日期］２００８－０２－１３

［作者簡介］

郭穎娜（１９７９－），女，助理工程師，從事質檢工作。

１２ｍｉｎ；與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對比，該法所需消化時間最短，試劑用量減少，可降低實驗成本，也降低了對環(huán)境的污染。

凱氏定氮法適用范圍廣泛，測定結果準確，重現(xiàn)性好，但操作復雜費時，試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置，可同時測定幾份樣品，節(jié)省時間，提高了工作效率，適用于批量蛋白質的測定，具有準確、快速、簡便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點。２雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）２．１原理

雙縮脲（ＮＨ３ＣＯＮＨＣＯＮＨ３）是兩個分子脲經１８０℃左右加熱，放出１個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與ＣｕＳＯ４形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以１個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。２．２特點

雙縮脲法中樣品的取用量對測定結果的準確性有顯著影響，采用０．５ｇ樣品，４０ｍＬ雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測精度。雙縮脲法對不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，不受溫度的影響�？煽焖贉y定蛋白質含量，試劑單一，方法簡便，但靈敏度差，測定范圍為１～２０ｍｇ蛋白質。適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定，常用于谷物蛋白質含量測定。３紫外吸收法３．１原理

蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性

第４期郭穎娜孫衛(wèi)：蛋白質含量測定方法的比較?３７?

質，吸收峰在２８０ｎｍ處，其吸光度（即光密度值）與蛋

白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在２３８ｎｍ的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。３．２特點

最常用的紫外吸收法是２８０ｎｍ的光吸收法，含有核酸的蛋白質溶液使用２８０和２６０ｎｍ的吸收差法較好。蛋白質的稀溶液采用２１５與２２５ｎｍ的吸收差法。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其絕對值。

缺點是測定蛋白質含量的準確度較差，干擾物質較多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質有一定的誤差，故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強吸收，但通過校正可以消除。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質吸收高峰常因ｐＨ的改變而有變化，因此要注意溶液的ｐＨ值，測定樣品時的ｐＨ要與測定標準曲線的ｐＨ相一致。４考馬斯亮藍法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）４．１原理

Ｂｒａｄｆｏｒｄ法是根據(jù)蛋白質與染料相結合的原理設計的�？捡R斯亮藍是一種有機染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基結合后變?yōu)樗{色，其最大吸收波長從４６５ｎｍ變?yōu)椋担梗担睿�，蛋白質在１～１０００μｇ范圍內，蛋白質－色素結合物在５９５ｎｍ波長下的吸光度與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。

４．２特點

考馬斯亮藍Ｇ－２５０與蛋白質結合反應十分迅速而穩(wěn)定，２ｍｉｎ左右即達到平衡，其結合物室溫下１ｈ內保持穩(wěn)定，且在５～２０ｍｉｎ之間，顏色的穩(wěn)定性最好。該法方法簡便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制。干擾物質少，如糖、緩沖液、還原劑和絡合劑等均不影響顯色。此法的缺點是由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Ｂｒａｄｆｏｒｄ法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用γ－球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Ｂｅｅｒ定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質的測定。５結語

４種蛋白質測定方法比較如表１所示。

表１

方法

靈敏度

蛋白質測定方法的比較

時間

原理

說明

量的準確測定；干

凱氏定靈敏度低，適用于氮法

０．２～１．０ｍｇ

費時，將蛋白質轉化為氮，用于標準蛋白質含８～１０ｈ用酸吸收后滴定。擾少；費時太長。

用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋

２＋

８～１０ｈＣｕ→紫色絡合物。白質顯色相似。

雙縮靈敏度低，適用于中速，脲法

１～２０ｍｇ

多肽鍵＋堿性

紫外吸較為靈敏，收法

５０～１００μｇ

用于層析柱流出

和色氨酸殘基在液的檢測；核酸的

５～１０ｍｉｎ２８０ｎｍ處的光吸收。吸收可以校正。最好的方法；干擾物質

白質結合時，λｍａｘ由少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺

５～１５ｍｉｎ４６５ｎｍ變?yōu)椋担梗担睿�。隨蛋白質不同而變化。

快速，蛋白質中的酪氨酸

考馬斯靈敏度最高，亮籃法１～５μｇ

快速，考馬斯亮藍染料與蛋

［參

２００６，（２）：１３２－１３４．

考文獻］

［１］李寧．幾種蛋白質測定方法的比較［Ｊ］．山西農業(yè)大學學報，［２］李存富．關于蛋白質測定中幾個問題的理論分析與討論［Ｊ］．中國釀造，２００４，（９）：２９－３０．

侯彩云．稻米蛋白質測定方法的比較與分析［Ｊ］．食品科技，［３］孫建平，２００５，７８－８１．

張庭芳，李令媛，等．生化實驗方法和技術［Ｍ］．北京：高等教［４］張龍翔，

育出版社，１９８１，１６４－１６９．

劉坤，李珊．食品中蛋白質含量測定方法的改進和應用［５］劉玉蘭，

［Ｊ］．青島醫(yī)學院學報，１９９９．

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