革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析

　　研究了菌齡、涂片厚度、媒染時間、乙醇脫色程度等對革蘭氏染色結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在進行革蘭氏染色時，大腸桿菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)時間不宜超過25小時，以下是小編為大家整理的革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析，僅供參考，希望能夠幫助大家。

　　革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析

　　革蘭氏染色應(yīng)用(原理，方法，步驟，優(yōu)缺點)

　　1. 革蘭氏染色液簡介：

　　革蘭氏染色是一種差異染色方法，用于根據(jù)細菌細胞壁的特性將細菌分為兩組（革蘭氏陽性和革蘭氏陰性）之一。它也被稱為革蘭氏染色法或革蘭氏法。該程序是以發(fā)明該技術(shù)的丹麥細菌學家漢斯·克里斯蒂安·格拉姆命名的。

　　2. 革蘭氏染色的工作原理

　　革蘭氏染色方法基于某些細菌細胞壁中肽聚糖之間的反應(yīng)。革蘭氏染色包括給：細菌染色，用染劑固定顏色，使細胞脫色，并進行復(fù)染。

　　a. 結(jié)晶紫與肽聚糖結(jié)合，將細胞染成紫色。革蘭氏陽性細胞和革蘭氏陰性細胞的細胞壁中都含有肽聚糖，所以最初，所有細菌都會染成紫色。

　　b. 碘和碘化鉀用作染色劑或固定劑。革蘭氏陽性細胞形成結(jié)晶紫碘復(fù)合物。

　　c. 用酒精或丙酮使細胞脫色。革蘭氏陰性細菌的細胞壁中的肽聚糖要少得多，因此這一步驟基本上使其無色，而革蘭氏陽性細胞中只有一些顏色被去除，這些細胞含有更多的肽聚糖（細胞壁的60-90%）。革蘭氏陽性細胞的厚細胞壁在脫色步驟中脫水，導致細胞收縮，并將染色碘復(fù)合物滯留在細胞內(nèi)。

　　4. 脫色步驟后，應(yīng)用復(fù)染（通常是藏紅，但有時是紫紅色）將細菌染成粉紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都會染上粉紅色的污漬，但在革蘭氏陽菌的深紫色上看不到。如果正確執(zhí)行染色程序，革蘭氏陽性菌將為紫色，而革蘭氏陰性菌將為粉紅色。

　　3. 革蘭氏染色技術(shù)的目的

　　用光學顯微鏡觀察革蘭氏染色的結(jié)果。由于細菌是有色的，因此不僅可以確定它們的革蘭氏染色組，還可以觀察到它們的形狀、大小和聚集模式。這使得革蘭氏染色對于醫(yī)療診所或?qū)嶒炇襾碚f是一種有價值的診斷工具。雖然染色可能無法明確識別細菌，但通常知道它們是革蘭氏陽性還是革蘭氏陰性就足以開有效抗生素的處方。

　　4. 革蘭氏染色技術(shù)的缺點

　　有些細菌可能是gram-variable or gram-indeterminate。然而，即使這些信息也可能有助于縮小細菌的范圍。當培養(yǎng)物不到24小時時，該技術(shù)最可靠。雖然它可以用于肉湯培養(yǎng)（但最好先離心處理）。該技術(shù)的主要局限性是，如果在該技術(shù)中出錯，則會產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。要產(chǎn)生可靠的結(jié)果，需要實踐經(jīng)驗和技能。此外，傳染源可能不是細菌。真核病原體染色為革蘭氏陰性。然而，除真菌（包括酵母）外，大多數(shù)真核細胞在這個過程中都無法粘附在載玻片上。

　　5. 革蘭氏染色所需材料

　　※ 結(jié)晶紫（主色）

　　※ 革蘭氏碘液（媒介染劑，用于將結(jié)晶紫固定在細胞壁中）

　　※ 乙醇或丙酮（脫色劑）

　　※ 藏紅花（二次染色或復(fù)染色）

　　※ 水壺或滴管瓶中的水

　　※ 顯微鏡載玻片

　　※ 復(fù)合顯微鏡

　　6. 革蘭氏染色步驟

　　a. 將一小滴細菌樣本放在載玻片上。將細菌通過本生燈的火焰加熱三次，將細菌固定在載玻片上。加熱過多或時間過長會融化細菌細胞壁、扭曲其形狀，導致結(jié)果不準確。如果加熱太少，細菌會在染色過程中從載玻片上洗掉。

　　b. 用滴管將原色（結(jié)晶紫）涂在載玻片上，讓其靜置1分鐘。用不超過5秒鐘的水輕輕沖洗載玻片，以去除多余的污漬。沖洗時間過長可能會去除太多顏色，而沖洗時間不夠長可能會使革蘭陰性細胞上殘留太多污漬。

　　c. 用滴管將革蘭氏碘涂在載玻片上，將結(jié)晶紫固定在細胞壁上。讓它靜置1分鐘。

　　d. 用酒精或丙酮沖洗載玻片約3秒鐘，然后立即用水輕輕沖洗。革蘭氏陰性細胞將失去顏色，而革蘭氏陽性細胞將保持紫色或藍色。然而，如果脫色劑打開時間過長，所有細胞都會失去顏色！

　　e. 涂上第二層著色劑藏紅花，靜置1分鐘。用水輕輕沖洗，沖洗時間不得超過5秒。革蘭氏陰性細胞應(yīng)染成紅色或粉紅色，而革蘭氏陽性細胞仍將呈現(xiàn)紫色或藍色。

　　f. 使用復(fù)合顯微鏡查看幻燈片�？赡苄枰�500倍至1000倍的放大倍數(shù)來區(qū)分電池形狀和排列。

　　影響革蘭氏染色結(jié)果準確性的關(guān)鍵因素。

　　1.試劑影響。首先應(yīng)確保使用的試劑須有效。實驗室應(yīng)當建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過期后的廢棄處理都應(yīng)有嚴格規(guī)定。

　　2.染色菌的選擇。菌齡對革蘭氏染色結(jié)果的影響是十分大的。染色過程中選擇的菌應(yīng)是處于活躍生長期，這樣的細菌活性強，生理特征明顯，染色結(jié)果準確度高，一般情況下不會出現(xiàn)誤差。培養(yǎng)時間較長的革蘭氏陽性菌，由于細胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細胞壁通透性增加，就會呈現(xiàn)出假陰性。

　　3.涂菌的狀態(tài)。在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應(yīng)該在無菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過程中，若是菌體堆積，也會極大影響染色結(jié)果的準確性。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。同時，在初染、媒染及復(fù)染的過程中，應(yīng)將染液覆蓋整個菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在涂片過程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達到最佳效果。

　　4.媒染時間。媒染時間對革蘭氏陰性菌的染色結(jié)果有很大影響。由于媒染時間過長，結(jié)晶紫在碘液長時間作用下過分牢固結(jié)合在菌體細胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會導致這種假陽性的效果。媒染時間控制在50-60s為宜。

　　5.酒精脫色。酒精脫色也是一個對結(jié)果影響較大的操作過程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌最主要的差異是細胞壁肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)，革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時，細菌細胞壁的多糖成分會被酒精溶解，增大了細胞壁的通透性，結(jié)晶紫及碘復(fù)合物就很快被酒精洗脫，之后就會被沙黃復(fù)染呈紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無法進入，這樣結(jié)晶紫和復(fù)合物就無法洗脫出來使細胞呈紫色。因此，酒精脫色時間短，脫色效果不佳，會導致陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和復(fù)合物不能有效的全部洗脫出來，就會出現(xiàn)明顯的誤差，使陰性菌出現(xiàn)假陽性。而洗脫時間過長，也會導致陽性菌的細胞壁被酒精破壞，導致細胞內(nèi)的紫色被洗脫，呈現(xiàn)假陰性。洗脫時間應(yīng)當嚴格控制在20s-30s之間，同時保證洗脫效果。

　　革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需嚴格控制的幾個方面：

　　染色菌必須是在其活躍期內(nèi)，

　　涂布狀態(tài)不可太厚，

　　媒染時間嚴格控制在50s-60s之間，

　　脫色時間嚴格控制在20s-30s。

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