杜氏鹽藻硝酸鹽還原酶缺陷型突變株的篩選與鑒定

目的:制備杜氏鹽藻氯酸鹽抗性突變株庫并從中篩選出硝酸鹽還原酶(NR)缺陷型突變株,測定其NRcDNA全長序列,分析其突變位點(diǎn).方法:①用乙基亞硝基脲(ENU)對杜氏鹽藻進(jìn)行誘變,得到突變株庫.然后用氯酸鹽抗性篩選方法獲得氯酸鹽抗性藻株,經(jīng)復(fù)篩和不同氮源生長試驗(yàn),獲得了氯酸鹽抗性突變株庫.再用96孔板法進(jìn)行單藻培養(yǎng),獲得氯酸鹽抗性突變株單藻群.用磺胺比色法測定各個(gè)單藻群的NR活性,挑選出NR活性完全喪失的突變株.然后用氯酸鹽抗性實(shí)驗(yàn)和不同氮源生長實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其NR突變的穩(wěn)定性.②根據(jù)已知的鹽藻NR全長序列,設(shè)計(jì)3對PCR引物,提取突變株鹽藻細(xì)胞mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,分3段擴(kuò)增其NR cDNA的全長序列,產(chǎn)物與T載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中,經(jīng)篩選后測序,測序結(jié)果與野生型鹽藻NR eDNA序列比較,分析其突變位點(diǎn).結(jié)果:序列分析表明,3株突變株共有11處相同的突變,其中的3處點(diǎn)突變引起了氨基酸性質(zhì)的改變.它們均在近3'端有一段相同的移碼突變,造成19個(gè)氨基酸的完全改變.此外,2株還分別由于在1 235和1 639的位點(diǎn)突變而產(chǎn)生了一個(gè)終止密碼子.結(jié)論:篩選出了3株杜氏鹽藻NR完全缺陷型突變株.

作 者： 李慎柯 賈巖龍 劉紅濤 李杰 魯照明 王建民 薛樂勛 LI Shenke JIA Yanlong LIU Hongtao LI Jie LU Zhaoming WANG Jianmin XUE Lexun   作者單位： 鄭州大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室,鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室,鄭州,450052  刊 名： 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）  ISTIC PKU 英文刊名： JOURNAL OF ZHENGZHOU UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)  年，卷(期)： 2006 41(3)  分類號： Q754  關(guān)鍵詞： 杜氏鹽藻   硝酸鹽還原酶   突變株  

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