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氨基酸分析法對蛋白定量的初步分析論文
近年來，生物技術(shù)藥物發(fā)展迅速，在疾病的預(yù)防、診斷及治療中發(fā)揮著重要作用，而重組蛋白類藥物在生物技術(shù)藥物中占有較大比重。蛋白質(zhì)含量測定是重組蛋白類藥物質(zhì)量控制中的重要指標(biāo)之一，準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)含量測定對產(chǎn)品的分裝、比活性計算、殘留雜質(zhì)的限量控制以及其他理化特性測定均具有重要意義。而蛋白含量測定標(biāo)準(zhǔn)品作為蛋白含量測定中的“標(biāo)準(zhǔn)”或“尺子”，其本身的準(zhǔn)確定量十分重要。
現(xiàn)行的蛋白含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品用于Lowry法或其他方法測定蛋白含量，其按《中國藥典》三部(2010版)、WHO、ICH標(biāo)準(zhǔn)品有關(guān)要求進行制備、分裝、凍干、質(zhì)量檢測，并開展了協(xié)作標(biāo)定。該標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)檢定，分裝精度(分裝誤差<1%)、外觀、無菌、水分(0.7%)均符合要求，并經(jīng)多家實驗室進行凱氏定氮協(xié)作標(biāo)定，結(jié)果為19.83mg/支。氨基酸分析是通過強酸或強堿破壞蛋白質(zhì)中的肽鍵，進而使蛋白質(zhì)水解為氨基酸的過程。再通過對組成蛋白質(zhì)的各個氨基酸的分析進而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的組成或定量分析。國外已有實驗室應(yīng)用氨基酸分析的方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行定量，本實驗旨在利用氨基酸分析的方法對蛋白含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品進行蛋白含量測定，并與凱氏定氮的結(jié)果進行比較，以探討氨基酸分析的方法用于該標(biāo)準(zhǔn)品或直接對其他重組蛋白定量的可行性。
1材料與方法
1.1標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品，批號：(2005)國生標(biāo)字0009，為本室保存。
1.2主要試劑及儀器17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液購自日本Ajinomoto公司;其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純;L8800型氨基酸分析儀購自日本Hitachi公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號為RE-52AA)購自上海亞榮生化儀器廠。
1.3氨基酸組成分析
1.3.117種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml，用0.02mol/L的鹽酸稀釋，容量瓶定容至50ml。將配制好的溶液作為樣品氨基酸組成分析的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在進樣的20μl中含脯氨酸4nmol，其他16種氨基酸2nmol。
1.3.2系統(tǒng)的適用性驗證色譜條件：用L8800型氨基酸組成分析儀進行分析，交換柱為46mm×60mm，填料為3m的磺酸型陽離子交換樹脂;柱溫：57℃，反應(yīng)器溫度：135℃，檸檬酸鈉緩沖液梯度洗脫，流速：0.4ml/min。各流動相的配制及洗脫程序均按照氨基酸分析的標(biāo)準(zhǔn)程序進行。取上述配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每針進樣20μl，連續(xù)進樣3針，計算各組分峰面積及保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation，RSD)，考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
1.3.3蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品最佳水解時間的考察分別精密稱取蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品5.4、5.1、5.7、5.7mg，加入氨基酸水解管中，加入6mol/L的鹽酸溶液5ml，充氮，密封。在110℃條件下分別水解16、20、24、28h。水解后的樣品全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行旋蒸，干燥后的樣品精確加入5ml水溶解，過0.45μm濾膜后上機備用。按照1.3.2項方法進行氨基酸組成分析，并計算回收率，考察蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品的最佳水解時間。
1.3.4蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品的氨基酸組成分析取蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品7支，從每一支標(biāo)準(zhǔn)品中精密量取人血白蛋白(humanserumalbumin，HSA)約5mg，分別加入氨基酸水解管中，加入6mol/L的鹽酸溶液5ml，充氮，密封。在110℃條件下，按照1.3.3項中確定的最佳水解時間進行水解。水解后的樣品全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行旋蒸。干燥后的樣品精確加入5ml水溶解，過0.45μm濾膜后上機備用。按照1.3.2項方法進行氨基酸組成分析，樣品每針進樣10μl。并計算RSD、變異系數(shù)(CV)及回收率，驗證方法的精密性及準(zhǔn)確性。
1.3.5數(shù)據(jù)處理將機器自動分析得到的各氨基酸含量(即10μl樣品中含有的ng數(shù))按照樣品濃度轉(zhuǎn)化為100mg樣品中的mg數(shù)(如精密稱量的樣品質(zhì)量為5.1mg，干燥后精確加入5ml水溶解，則樣品濃度為：5.1mg/5ml=102mg/100ml，氨基酸分析測得的天門冬氨酸為939.64ng/10μl，則樣品中天門冬氨酸含量為8.70mg/100mg)。通過對7支樣品的測定，得到每種氨基酸測得結(jié)果的平均值，對測得的17種氨基酸的量進行加和，即可算出100mg樣品中測得的樣品mg數(shù)，進而計算出氨基酸分析儀測得的蛋白含量為實際稱量的蛋白含量的百分?jǐn)?shù)。另取蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品5支，按《中國藥典》三部(2010版)“裝量差異”法要求，計算其平均裝量，與上述氨基酸分析得到的百分?jǐn)?shù)相乘，即為蛋白含量值。
2結(jié)果
2.1系統(tǒng)的適用性試驗結(jié)果顯示，連續(xù)進樣3針系統(tǒng)對各氨基酸組分均有良好的分離，其中各組分峰面積的RSD均小于1.5%，保留時間的RSD均小于1%，Thr-Ser、Gly-Ala和Ile-Leu均得到較好的分離，見圖1。表明色譜分離條件合適，系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，可滿足分析的需要。
2.2蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品的最佳水解時間由于蛋白質(zhì)樣品在酸水解過程中會不同程度地造成氨基酸的水解破壞，理論上推測該方法測得的蛋白含量應(yīng)小于實際稱量的蛋白量，因此，排除與100%最為接近的20h水解樣品得到的102.75%，選擇結(jié)果為96.55%的水解樣品的水解時間24h。
2.3蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品的氨基酸組成分析經(jīng)計算，蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品樣品的含量值為(95.02±3.99)mg/100mg，RSD為4.20%。7次測定中，各氨基酸含量測定值的CV均小于1%。標(biāo)準(zhǔn)品中各氨基酸的回收率在93.56%～105.12%之間。5支蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品平均裝量為0.0216g，即21.6mg，推算出國家標(biāo)準(zhǔn)品中白蛋白含量為20.52mg，與現(xiàn)行的凱氏定氮標(biāo)定值(19.83mg)相比偏高，為其測定值的103.48%。
3討論
質(zhì)量控制的重要原則之一是能夠進行量值溯源，標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確定量是其中最重要的環(huán)節(jié)。本研究中蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品的原料為HSA，是通過對健康人血漿采用低溫乙醇蛋白分離法或其他方法制備的，在制成標(biāo)準(zhǔn)品時，僅添加了磷酸鹽，因此其適合進行氨基酸分析，而無干擾。在數(shù)據(jù)處理過程中，采用稱重法將氨基酸分析法測得的蛋白含量值最終溯源到砝碼上，主要是由于該標(biāo)準(zhǔn)品為白蛋白純品，添加的微量磷酸鹽可忽略不計，稱量所得質(zhì)量與實際質(zhì)量應(yīng)相符，實際稱量值可對測得值進行驗證，保證了測得結(jié)果的準(zhǔn)確性。
對蛋白質(zhì)進行氨基酸分析，首先要將其肽鍵斷裂(水解)形成游離氨基酸。水解過程中，Asn變成Asp，Gln變成Glu。本實驗采用的是氨基酸分析儀，其原理是茚三酮柱后衍生法，即水解后的游離氨基酸經(jīng)陽離子交換色譜柱分離后，與茚三酮反應(yīng)，其中Pro與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色產(chǎn)物，在440nm處檢測該產(chǎn)物，其他氨基酸與茚三酮反應(yīng)則生成藍(lán)紫色產(chǎn)物，在570nm處進行檢測。通過分離得到的各氨基酸的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品中對應(yīng)氨基酸峰面積進行比較，實現(xiàn)對各氨基酸的定量。在實際應(yīng)用中，也可應(yīng)用特定的試劑盒，結(jié)合高效液相色譜法進行氨基酸分析，避免了專一設(shè)備昂貴，不易于推廣的缺點。氨基酸分析進行蛋白質(zhì)定量具有以下優(yōu)勢：首先，凱氏定氮樣品需求量較大，在一定程度上限制了該方法的應(yīng)用，而氨基酸分析的方法自動化程度高，重復(fù)性好，所需樣品量少，對于較難獲得或樣品量不大的標(biāo)準(zhǔn)品適于用氨基酸分析法定量;其次，目前廣泛采用的Lowry、BCA、Bradford等方法均是與蛋白中的特定氨基酸或特定基團反應(yīng)，各種蛋白其氨基酸組成不同，必定對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。另外，標(biāo)準(zhǔn)品不同質(zhì)也會產(chǎn)生誤差，而氨基酸分析是對不同蛋白的個性化分析，可避免上述缺點;再次，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，新的、復(fù)雜蛋白不斷出現(xiàn)，糖基化、PEG化引起的蛋白結(jié)構(gòu)變化使原有的含量測定方法不適用，而氨基酸分析不受結(jié)構(gòu)的影響，具有一定的優(yōu)勢。
本研究將氨基酸分析法得到的定量值與凱氏定氮值進行比較，以考察氨基酸分析定量方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，兩者無明顯差異，初步表明本研究所采用的氨基酸分析方法對現(xiàn)行蛋白含量國家標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白含量測定準(zhǔn)確，但還需進行更進一步的研究。
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