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探討公共衛(wèi)生快檢中微流控芯片的運(yùn)用論文
在我國(guó)的公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)工作中，目前面臨的一個(gè)難題是，執(zhí)法人員在現(xiàn)場(chǎng)采集樣品后，依據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)無法快速得出結(jié)果，往往需要送到省會(huì)城市的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析測(cè)試，不但需要耗時(shí)數(shù)天乃至數(shù)周，而且價(jià)格昂貴，不利于衛(wèi)生執(zhí)法工作的現(xiàn)場(chǎng)開展。因此亟需一種具有便攜、快速和低成本特性的檢測(cè)技術(shù)，能夠在現(xiàn)場(chǎng)得出結(jié)果。微流控芯片正是一種能夠?qū)鹘y(tǒng)檢測(cè)技術(shù)微縮化的平臺(tái)，這些芯片的體積往往只有數(shù)平方厘米，重量約數(shù)十克，特別便于攜帶，而且對(duì)樣本和試劑的需求量極低，因此在公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊。
1 微流控芯片技術(shù)
微流控芯片技術(shù)，或稱芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab on A Chip）和微機(jī)電技術(shù)（Micro Electro Mechanical System，MEMS），興起于20世紀(jì)末期，并于21世紀(jì)初最早由方肇倫院士引入我國(guó)。微流控芯片技術(shù)集成了生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、微機(jī)電和微加工技術(shù)，通過在聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、單晶硅和玻璃等材料上構(gòu)建精密尺寸的微管道、閥門和腔室，由于芯片內(nèi)部管道和腔室的尺寸通常在微米甚至納米尺度，因此反應(yīng)所需的樣本量和試劑消耗量都極低（比常規(guī)檢測(cè)方法降低數(shù)倍至數(shù)百倍），適合于對(duì)稀少樣本的檢測(cè)[1]。例如Fang等[2]構(gòu)建的快速核酸分析芯片，能夠在2μL的反應(yīng)體系中對(duì)樣本進(jìn)行快速擴(kuò)增，試劑和樣本的消耗量比常規(guī)方法降低了十倍。此外，微小體系中的流體具有很多新的特性，例如芯片內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速率往往比常規(guī)反應(yīng)高一至兩個(gè)數(shù)量級(jí)，很多常規(guī)方法需要數(shù)小時(shí)的反應(yīng)，在芯片內(nèi)部?jī)H需數(shù)分鐘或數(shù)秒鐘[3]。Yuan等[4]構(gòu)建的檢測(cè)腦脊液中金黃葡萄球菌的微流控芯片系統(tǒng)，從樣本處理到得出檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間縮短到60 min，能夠在現(xiàn)場(chǎng)快速得出檢測(cè)結(jié)果。相比于常規(guī)技術(shù)，微流控芯片的優(yōu)勢(shì)主要有 ：①體積小。微型化的反應(yīng)單元所需的試劑和樣品消耗量很低，能夠極大地降低成本 ；同時(shí)，微小的芯片便于攜帶，有利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的應(yīng)用 ；②集成化和自動(dòng)化程度高。通過微加工技術(shù)，可以方便地在芯片內(nèi)整合多個(gè)反應(yīng)單元，從而有利于實(shí)現(xiàn)高通量并行檢測(cè)�？梢�，如果能夠?qū)⑽⒘骺匦酒夹g(shù)應(yīng)用于公共衛(wèi)生事業(yè)，就可以提高現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法的效率，給予現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法人員更高的自由度，同時(shí)，設(shè)備成本的大幅降低將使我國(guó)公共衛(wèi)生工作的監(jiān)測(cè)范圍更廣，利于實(shí)現(xiàn)在全國(guó)不同經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度地區(qū)的大范圍普及。
微流控芯片技術(shù)可以運(yùn)用于諸多領(lǐng)域，不但能優(yōu)化傳統(tǒng)的分析檢測(cè)技術(shù)，更體現(xiàn)了自身的獨(dú)特潛力和巨大優(yōu)勢(shì)。但是該技術(shù)在我國(guó)的起步較晚，目前，基于該技術(shù)開發(fā)的微型便攜式設(shè)備在醫(yī)學(xué)診斷、衛(wèi)生檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域都剛剛嶄露頭角。
2 微流控芯片技術(shù)在空氣傳播性疾病快檢中的應(yīng)用
空氣傳播疾病具有傳播速度快、范圍廣和難于監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)，一旦擴(kuò)散很容易造成大范圍污染，導(dǎo)致公眾恐慌[5]。例如2003年爆發(fā)的非典及近年的禽流感疫情，都因?yàn)槿狈τ行У目焖贆z測(cè)手段，而無法對(duì)空氣病原菌的傳播方位進(jìn)行及時(shí)快速的監(jiān)控。傳統(tǒng)的空氣微生物檢測(cè)技術(shù)主要有落板培養(yǎng)法和安德森采樣器法，原理均是將空氣中的微生物收集在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，再通過顯微鏡鏡檢進(jìn)行分析[6]。這些傳統(tǒng)方法的嚴(yán)重缺陷是 ：①自然界絕大多數(shù)微生物尚無法培養(yǎng)，可培養(yǎng)的微生物只占總數(shù)的不到1%[7]，因此可檢測(cè)出的微生物種類極為有限 ；②即便能夠培養(yǎng)生長(zhǎng)，從空氣樣本采集到得出檢測(cè)報(bào)告，也往往需要數(shù)天到一周的時(shí)間，無法滿足實(shí)時(shí)快速的檢測(cè)需要。正因?yàn)榇�，�?duì)空氣傳播疾病的監(jiān)測(cè)和早期預(yù)防始終是一個(gè)世界性難題，同時(shí)也是我國(guó)空氣衛(wèi)生監(jiān)測(cè)工作面臨的重要挑戰(zhàn)。
本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)這一問題進(jìn)行了深入研究，并構(gòu)建了世界首個(gè)能夠快速捕獲、富集和檢測(cè)空氣中的病原微生物的微流控芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)含有一種特殊的魚骨狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)空氣在這種結(jié)構(gòu)的上方流過時(shí)，空氣中的微生物能被截留下來并保存在芯片的管道內(nèi)。而后，利用微小體系的洗脫液對(duì)捕獲到的微生物進(jìn)行洗脫富集，就可以很方便地得到高濃度的空氣微生物富集液，以便進(jìn)行下游分子生物學(xué)分析。2012年，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了含有芯片PCR快速擴(kuò)增模塊的分析系統(tǒng)，并以空氣氣溶膠中的大腸桿菌、金黃葡萄球菌和肺炎克萊伯桿菌等為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了可靠性驗(yàn)證。該芯片可以在3個(gè)小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)從空氣微生物的采集到PCR擴(kuò)增完成，所需試劑消耗僅為傳統(tǒng)方法的十分之一。整個(gè)系統(tǒng)可由電池供電，體積很小攜帶，適合于在野外或公共場(chǎng)所進(jìn)行針對(duì)空氣病原微生物的快速檢測(cè)[1]。自2003年SARS疫情之后，人們對(duì)呼吸道病原體的快速篩查鑒定技術(shù)提出了更高的要求。已知的呼吸道病原體已超過二十余種，利用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)只能對(duì)病原體樣本進(jìn)行逐一擴(kuò)增，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，顯然無法滿足疫情控制和突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置的需要。為了解決這個(gè)問題，筆者于2013年分別構(gòu)建了含有高通量微柱式酶聯(lián)免疫測(cè)定（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay，ELISA）模塊[8]和高通量恒溫核酸擴(kuò)增（Loop—mediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP）模塊[4]的分析系統(tǒng)，其原理是巧妙地在微流控芯片內(nèi)部設(shè)計(jì)了大規(guī)模并行式微反應(yīng)單元，可以實(shí)現(xiàn)在一次實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)同一樣本進(jìn)行多種不同指標(biāo)的并行式檢測(cè)反應(yīng)。2014年，通過進(jìn)一步使用這種微流控芯片系統(tǒng)在山東省省立醫(yī)院對(duì)人流量密集的門診大廳、急診病房和公共走廊等地進(jìn)行了空氣中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)分析，這是世界上首次進(jìn)行此類研究。該研究成果尚未發(fā)表，但此項(xiàng)研究成果為公共場(chǎng)所空氣病原微生物的快速檢測(cè)提供了一種全新的技術(shù)平臺(tái)，利用這種微流控芯片技術(shù)，有望構(gòu)建對(duì)空氣氣溶膠所含多種傳染性病原微生物進(jìn)行高通量、全自動(dòng)的在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的分析系統(tǒng)。
3 微流控芯片技術(shù)在微生物現(xiàn)場(chǎng)快檢中的應(yīng)用
在人群密集的公共場(chǎng)所，很多傳染性疾病具有較強(qiáng)的隱蔽性，危害較大。對(duì)于我國(guó)公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)部門來說，能夠快速檢測(cè)出這些病原微生物，并向公眾提出流行性疾病的預(yù)警信息，是極為重要的一項(xiàng)工作內(nèi)容。但是，受限到傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的限制，目前尚缺乏對(duì)公共場(chǎng)所病原微生物的快速檢測(cè)方法，監(jiān)測(cè)結(jié)果缺乏時(shí)效性。尤其是在偏遠(yuǎn)地區(qū)，此類快速檢測(cè)更是難以開展。為了解決這個(gè)問題，當(dāng)前的一個(gè)研究方向是將微流控芯片技術(shù)與LAMP技術(shù)相結(jié)合。LAMP技術(shù)是一種在恒溫條件下進(jìn)行核酸分子擴(kuò)增的新技術(shù)，具有較高的靈敏度，而且所得到的結(jié)果肉眼可見。在微流控芯片內(nèi)部進(jìn)行微小體系的LAMP核酸擴(kuò)增反應(yīng)，不但對(duì)樣品的需求量極低（通常為微升或納升），而且往往可以在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成從樣品的采集到檢測(cè)結(jié)果的得出，速度快、消耗低，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要[4]。例如復(fù)旦大學(xué)方雪恩博士構(gòu)建的一種數(shù)平方厘米大小的微反應(yīng)芯片，可以同時(shí)對(duì)3種不同亞型的大腸桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)，這些芯片造價(jià)低廉，便于攜帶，而且無需復(fù)雜的設(shè)備讀取結(jié)果[9]。本實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的一種能夠快速檢測(cè)病原微生物的芯片設(shè)備，能夠?qū)︶t(yī)院等公共場(chǎng)所采集的樣本進(jìn)行快速分析，從采樣到得出檢測(cè)結(jié)果總耗時(shí)約1 h，同時(shí)，芯片反應(yīng)體系只需約1。5μL的試劑消耗量，而芯片本身的造價(jià)也僅為十余元，在成本上具有很大優(yōu)勢(shì)。該系統(tǒng)在針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床樣本的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，均獲得了特異性較高的結(jié)果，穩(wěn)定性較好[4]。這種便攜性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單而且結(jié)果肉眼可見的微流控芯片，對(duì)于偏遠(yuǎn)山區(qū)或?yàn)?zāi)區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)，以及戰(zhàn)場(chǎng)或生物反恐所需的快速檢測(cè)，都有重要的應(yīng)用價(jià)值。
另外，微流控芯片具有易于跟其它技術(shù)相整合的特性，例如Stedtfeld等[10]將微流控檢測(cè)芯片與智能手機(jī)聯(lián)用，能夠?qū)⑿酒汐@得的光學(xué)信號(hào)輸入手機(jī)，并利用手機(jī)軟件進(jìn)行運(yùn)算分析，這就特別適合于衛(wèi)生執(zhí)法人員在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，也有利于實(shí)現(xiàn)公眾直接參與公共衛(wèi)生監(jiān)察，有利于提1Lilehoj等[11]在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)的芯片系統(tǒng)，是通過特異性抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)瘧原蟲的特異性識(shí)別和捕獲，并將產(chǎn)生的微弱的電信號(hào)傳導(dǎo)至手機(jī)中，再利用手機(jī)的智能軟件進(jìn)行深入分析處理。Navruz等[12]則將微流控芯片與智能手機(jī)的攝像頭相連接，構(gòu)建了便攜型顯微呈象系統(tǒng)，能夠?qū)ξ矬w表面的病原微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)呈象分析。這些最新的研究進(jìn)展，都是利用微流控芯片的便攜性，針對(duì)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)的嘗試。值得一提的是，近年在我國(guó)興起的“健康云”的概念，也是利用手機(jī)等便攜式終端將現(xiàn)場(chǎng)數(shù)據(jù)通過網(wǎng)絡(luò)上傳的中心實(shí)驗(yàn)室服務(wù)器，并在實(shí)驗(yàn)室得出更精密的檢測(cè)結(jié)論后再發(fā)送給用戶，這種云網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)依賴于一種微型且快速高效的生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)端，而微流控芯片技術(shù)恰好可以滿足這種需求，不但可以替代昂貴的儀器設(shè)備，而且具有更高的檢測(cè)靈敏度，更有利于簡(jiǎn)化繁瑣的操作步驟。在公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，如果也能建立起類似的云系統(tǒng)，就便于一線執(zhí)法人員快速得到檢測(cè)結(jié)果，從而促進(jìn)衛(wèi)生監(jiān)察工作的快速和科學(xué)開展。
4 微流控芯片技術(shù)在水體微生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用
水是病原微生物傳播的主要媒介之一，世界各地由于病原生物污染水源而引發(fā)的大規(guī)模疾病暴發(fā)事件屢見不鮮，而發(fā)展中國(guó)家更是有數(shù)億人的生活用水得不到安全保障。水質(zhì)監(jiān)管部門除了要對(duì)水中有毒有害化合物和重金屬進(jìn)行監(jiān)測(cè)外，還要兼顧對(duì)水中病原微生物的檢測(cè)。而在水體微生物檢測(cè)中，受限于已有的檢測(cè)分析技術(shù)，往往需要將樣品采集、病原體富集、病原體分離純化以及病原微生物鑒定等工作分時(shí)分地完成，工作效率很低[13]。為此，世界多國(guó)政府將目光投向了微流控芯片技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的微流控芯片，能夠在20 min內(nèi)檢測(cè)水體中的阿米巴蟲，所需樣本量?jī)H為2μL[14]。而通過在芯片內(nèi)部整合生物免疫磁珠或電化學(xué)等技術(shù)，則可以高效完成對(duì)于水中一種或多種特定微生物的富集工作。例如Guan等[15]采用芯片免疫磁珠分離法對(duì)水中大腸桿菌富集率可達(dá)92%~96%。而利用微流控芯片的特殊結(jié)構(gòu)，則能夠在富集藍(lán)賈第鞭毛蟲卵囊和隱孢子蟲孢囊的同時(shí)，將它們按照尺寸大小的不同分選出來[16]。采用微流控技術(shù)完成富集工作的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，通過在芯片內(nèi)整合檢測(cè)模塊，就可以將下游檢測(cè)所需的固定和染色等步驟全部整合到一塊芯片上完成，再通過配合使用便攜式光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，就能方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中寄生蟲卵的信息進(jìn)行快速獲取，特別是對(duì)于寄生蟲孢囊或卵囊的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)較為成熟。富集到的細(xì)菌或病毒可以直接在芯片上完成從細(xì)胞裂解到核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物鑒定等全部工作流程，從而在基因水平上完成對(duì)病原微生物的精確鑒定。
目前，基于微流控芯片開發(fā)的檢測(cè)設(shè)備對(duì)大腸桿菌和隱孢子蟲等病原微生物的檢測(cè)極限可以達(dá)到單個(gè)細(xì)胞的水平，這得益于在微流控芯片內(nèi)部構(gòu)建的微型單細(xì)胞捕獲和實(shí)時(shí)檢測(cè)模塊，并可以很方便地實(shí)現(xiàn)精確定量[17]。將微流控技術(shù)與光學(xué)系統(tǒng)和電子設(shè)備整合一體，以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析也是當(dāng)下一個(gè)重要的研究方向[18]。另外，對(duì)于前期水樣采集和預(yù)處理環(huán)節(jié)的技術(shù)革新與優(yōu)化同樣影響著微流控技術(shù)在水質(zhì)監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展。可以預(yù)見，基于微流控芯片的分析設(shè)備將極大降低水質(zhì)監(jiān)測(cè)的成本，提高水檢部門的工作效率，提高偏遠(yuǎn)地區(qū)的水體微生物監(jiān)測(cè)水平。
5 展望
微流控芯片技術(shù)興起的時(shí)間較短。但近年來該技術(shù)在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)受到了極大的關(guān)注。尤其是2006年Nature雜志長(zhǎng)篇幅詳細(xì)報(bào)道了微流控芯片的發(fā)展，并將其評(píng)價(jià)為“這一世紀(jì)的技術(shù)”[19]以后，微流控芯片逐漸成為了涵蓋生物、化學(xué)和醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域的新的技術(shù)制高點(diǎn)，但遺憾的是在我國(guó)的研究較少，距離實(shí)際應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。微流控芯片技術(shù)在我國(guó)公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)，尤其是現(xiàn)場(chǎng)快檢領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊，在不久的將來甚至有望引領(lǐng)一場(chǎng)微型醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)的革命。
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