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真菌培養(yǎng)及鑒定
真菌培養(yǎng)及鑒定、真菌培養(yǎng)及鑒定
1.采集標(biāo)本 體表真菌的標(biāo)本有毛發(fā)、皮屑、甲屑、痂等，標(biāo)本在分離前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的標(biāo)本可根據(jù)情況取痰、尿液、糞便、膿液、口腔或陰-道分泌物、血液、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織，采集標(biāo)本應(yīng)注意無菌操作。
2.培養(yǎng)檢查：可提高真菌檢出率，并能確定菌種。標(biāo)本接種于葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud agar)上，置室溫或37℃培養(yǎng)1～3周。必要時可行小培養(yǎng)協(xié)助鑒定。菌種鑒定常根據(jù)菌落的形態(tài)及顯微鏡下形態(tài)判斷。對某些真菌，有時尚需配合其他鑒別培養(yǎng)基、生化反應(yīng)、分子生物學(xué)方法確定。
真菌培養(yǎng)的方法與直接鏡檢法相比較而言，更能對大部分真菌感染的灰指甲作出準(zhǔn)確的鑒定，也是診斷灰指甲的一個很重要的手段。下面我們就從培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)時間、菌種鑒定三方面來了解一下灰指甲的真菌培養(yǎng)法。
1.培養(yǎng)基的選擇
通常培養(yǎng)真菌會同時選用兩種培養(yǎng)基，如果單用一種培養(yǎng)基，則容易忽略其它種類的真菌診斷。常見的兩種培養(yǎng)基，一種為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中加抗菌劑，常為氯霉素和放線菌酮;另一種是沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中僅加氯霉素，不加放線菌酮。
2.培養(yǎng)時間
各種真菌的生長速度不同，所以報告的時間也不同。一般皮膚癬菌生長較緩慢，在26℃-28℃的環(huán)境下需要培養(yǎng)2-4周才能發(fā)報告，但是，皮膚癬菌含蓋的菌種較多也需要區(qū)別對待;酵母菌生長較快，通常2-3就可以發(fā)報告，如果為陰性則需要觀察1周;霉菌生長也比較快，一般2-4天就可以發(fā)報告。
3.菌種鑒定
(1)絲狀真菌：包括皮膚癬菌和霉菌，根據(jù)菌落形成所需要的時間，在不同條件下生長的情況，菌落表面及背面的形態(tài)、色素，培養(yǎng)基中有無色素，培養(yǎng)物用乳酚棉藍(lán)染色后鏡檢找特征性標(biāo)志結(jié)構(gòu)。(2)酵母菌：分為形態(tài)學(xué)鑒定及生化試驗。形態(tài)學(xué)鑒定主要觀察有無假菌絲產(chǎn)生，如有則為念珠菌屬，如無則為念珠菌以外的酵母菌;生化試驗最為常用的是API系統(tǒng)，用此法鑒定準(zhǔn)確，但價格較貴。
)絲狀真菌：主要是形態(tài)學(xué)的鑒定，如直接涂片觀察，小培養(yǎng)顯微鏡鑒定，誘導(dǎo)形態(tài)觀察(25℃與35℃下雙相型真菌的特征孢子及菌絲的產(chǎn)生和兩種菌落的形成及腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，KT培養(yǎng)基，KelleyAgar培養(yǎng)基轉(zhuǎn)相誘導(dǎo)，另外常用的還有皮膚癬菌VB1生長刺激，吳氏熒光檢查，毛發(fā)穿孔試驗及在特殊情況下進(jìn)行的一些生化鑒定等。其中，小培養(yǎng)顯微鏡檢對于絲狀真菌的鑒定，特點是動態(tài)直觀，易于觀察，且節(jié)約材料。解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科馬天
(2)酵母菌鑒定：形態(tài)學(xué)鑒定主要是玉米吐溫誘導(dǎo)下特征菌絲及特征孢子的檢驗，血清芽管形成，而在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上還必須進(jìn)行生化鑒定：有標(biāo)準(zhǔn)鑒定，自動儀器鑒定，顯色鑒定，其中，自動儀器鑒定(如API20C，ID32C等)，顯色鑒定對于酵母樣真菌的鑒定，特點是快速簡便;標(biāo)準(zhǔn)鑒定是按傳統(tǒng)雙歧表流程鑒定(包括糖同化試驗，糖發(fā)酵試驗，CAFC酚氧化酶試驗，尿酶試驗，KNO3同化試驗，脂肪酸需求試驗)，是真菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)準(zhǔn)確，缺點是程序繁瑣，耗時長，與臨床治療不太適應(yīng)。此外，還有血清學(xué)玻片凝集試驗，動物致病性實驗，分子生物學(xué)鑒定：如核酸雜交，DNA探針雜交，PCR擴(kuò)增序列分析，PCR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，PCR-RFLP限制性片段長度多態(tài)性分析，PCR-RAPD隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析，PFCG脈沖電泳核型分析等。
對于酵母樣真菌首選CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基，而顯色培養(yǎng)基不能鑒定的酵母樣真菌可采用自動儀器YBC卡進(jìn)行鑒定或API板;條件較差的實驗室可采用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)鑒定法中鑒定值較高的試驗，如酚氧化酶鑒定新型隱球菌(+)，尿素區(qū)分毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(-)，念珠菌屬(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(+)，玉米-土溫培養(yǎng)基上產(chǎn)菌絲區(qū)分念珠菌屬(+)與球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(-)與毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(+)。而同化試驗推薦平皿法，一個平皿內(nèi)可觀察多種糖類的同化情況，且結(jié)果易于觀察，重復(fù)性好。對于絲狀真菌及雙相型真菌，可采用小培養(yǎng)法，快速簡便易于觀察。而對于雙相型真菌還須經(jīng)過腦心浸液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)相試驗后確證。而血清學(xué)及分子生物學(xué)則主要用于流行病學(xué)和一些難培養(yǎng)難鑒定真菌的檢驗，由于成本高或要求技術(shù)難度較高，故而不適合在常規(guī)工作中采
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